70 страниц
54% уникальность
2023 год
4 просмотров
На Work5 вы можете заказать недорого контрольную работу в Хабаровске и не переживать за качество.
Здесь мы получили экспрессирующие трастузумаб клетки CHO-K1 с помощью стратегии скрининга и отбора, которая сочетала использование клеток-хозяев, предварительно адаптированных к среде без белка, и суспензионной культуре, и лентивирусных векторов. Результаты показали, что стратегия раннего скрининга позволила получить рекомбинантные популяции клеток CHO-K1 с более высоким содержанием клеток, экспрессирующих IgG. Более того, измерение внутриклеточного полипептида с тяжелой цепью методом проточной цитометрии было полезным показателем для характеристики однородности клеточной популяции, и наши результаты предполагают, что это может быть использовано для прогнозирования уровней экспрессии моноклональных антител на ранних стадиях развития клеточной линии. Кроме того, мы предлагаем подход с использованием 25 см2 Т-колб в условиях суспензии и встряхивания культуры в качестве инструмента скрининга для выявления высокопродуктивных клеточных линий. Наконец, экспрессирующие трастузумаб клоны CHO-K1 были получены и охарактеризованы с помощью периодического культивирования, и предварительные результаты, относящиеся к способности распознавать HER2, были успешными. Дальнейшая оптимизация таких элементов, как оптимизация генов, селекция векторов, тип системы амплификации/селекции, состав среды для культивирования клеток, в сочетании с этой стратегией позволит получать высокопродуктивные клоны. Выдающиеся достижения трастузумаба в клинических условиях вошли в историю систематического лечения рака молочной железы. К сожалению, он не всегда доступен для обычного использования из-за его непомерно высокой стоимости (Pivot и Petit 2018). Истечение срока действия патента Европейского союза (ЕС) на трастузумаб в 2014 году и последняя версия патента США в 2019 году (Nelson 2014) способствовали разработке биоаналогов к этому антителу (Curigliano et al., 2016). Биоаналоги, по прогнозам, будут на 20-30% дешевле эталонного продукта. По этой причине ожидается, что он окажет положительное влияние с точки зрения экономической эффективности и повышения доступности и доступности таргетных методов лечения (Paplomata и Nahta 2018). Чтобы гарантировать доступ кубинских пациентов к этой непомерно дорогой терапии, Центр молекулярной иммунологии (CIM, Гавана, Куба) решил разработать биоаналог трастузумаба, продуцируемого клетками CHO-K1.Использование клеток CHO для производства терапевтических белков имеет много преимуществ, таких как более легкая адаптация к выращиванию в средах без сыворотки и / или химически определенных средах, способность достигать высокой плотности клеток в суспензионной культуре, высокий титр продукта и сходные схемы гликозилирования с клеточными линиями человека (Bandaranayake and Almo 2014; Kim et al. др., 2012; Кейстерманс и Аль-Рубеаи, 2015a; Спирмен и Батлер, 2015). В настоящее время платформы на основе клеток CHO используют клетки, предварительно адаптированные для выращивания в химически определенных средах без сыворотки и суспензионной культуре, чтобы сократить время и усилия, связанные с адаптацией рекомбинантных клеточных линий CHO (Jostock 2011; Kim et al. 2012). Кроме того, эти клетки могут быть легко трансдуцированы с использованием лентивирусных векторов (LVS) (Gaillet et al. 2010; Oberbek et al. 2011). Этот метод трансфекции использует преимущества механизмов LV для стабильной интеграции в хромосоме клеток, в частности, в транскрипционно активные области. Эта особенность делает их отличными инструментами для получения клеточных линий с высокими уровнями экспрессии целевых рекомбинантных белков (Gödecke et al. 2018; Mursi and Masuda 2018). LVs как метод переноса генов предоставляет дополнительные возможности для оптимизации, поскольку позволяет регулировать соотношение вируса и клеток (множественность инфекции, MOI) для модуляции количества копий трансгена и / или процента инфицированных клеток (Gödecke et al. 2018; Oberbek et al. 2011).После того, как клетки трансфицированы, следующим важным шагом является идентификация желательных вариантов или клонов из гетерогенного пула трансфектантов (Priola et al., 2016). Было использовано несколько методов, от автоматизированных методов клонирования, таких как ClonePix FL ™ и Cello™ system, до ручных методов, таких как клонирование с ограничением разведения (Kuystermans and Al-Rubeai 2015b).Что касается продукции антител, в нескольких отчетах была продемонстрирована положительная корреляция между продуктивностью (объемной или специфической) и уровнями мРНК или внутриклеточных полипептидов легкой цепи (LC) или тяжелой цепи (HC) с использованием проточной цитометрии. Несмотря на противоположные результаты по этому вопросу (Borth et al. 1999; Chusainow et al. 2009; Dorai et al. 2006; Edros et al. 2013; Jiang et al. 2006; Lattenmayer et al. 2007; Lee et al. 2009; Park and Ryu 1994; Roy et al. 2017), будет важно проверить, могут ли эти переменные предсказывать уровни экспрессии целевых антител на ранней стадии процесса разработки клеточной линии, чтобы сократить время получения рекомбинантных клеточных линий. В настоящей работе мы создали несколько экспрессирующих трастузумаб клеточных линий, следуя иной стратегии, чем ранее использовавшейся для получения других биоаналогичных кандидатов из клеток NS0 и клеток CHO-K1 в CIM (неопубликованные данные). В этих случаях весь процесс разработки клеточной линии и оценки продуктивности проводили в среде с добавлением сыворотки и в адгезивной культуре с последующим этапом адаптации суспензии без сыворотки. Здесь мы объединили использование клеток CHO-K1, предварительно адаптированных для роста в среде без белка и суспензионной культуре, трансдукцию лентивирусными векторами, этап раннего скрининга и раннюю адаптацию рекомбинантных клеточных линий, полученных в вышеупомянутых условиях. Кроме того, оценка уровней экспрессии и скрининг продуцирующих клеточных линий проводились в условиях, более похожих на условия конечного производственного процесса. Наши результаты показывают, что измерение внутриклеточного полипептида HC методом проточной цитометрии может быть использовано для прогнозирования уровней экспрессии моноклональных антител на ранних стадиях. Это было бы выгодным подходом для отбора пулов клеток-предшественников, обогащенных высокопродуктивными клонами. Кроме того, биоаналоги к экспрессирующим трастузумаб клонам были охарактеризованы с помощью пакетной культуры. Наконец, способность рекомбинантного антитела распознавать молекулу HER2, экспрессируемую в линиях опухолевых клеток, оценивали методами проточной цитометрии.
