СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ»

В организме человека обитает более 500 видов микробов. Большая часть микробов в количестве 1-2 кг сосредоточена в кишечнике. Понятно, что традиционные методы исследования 10 –15 видов микрофлоры фекалий не в состоянии отразить реальную картину качественного и количественного состава микрофлоры кишечника. Развитие в последнее десятилетие молекулярных методов микробиологических исследований дает возможность расширить сведения о видовом составе микробиоты кишечника. Для диагностики дисбактериоза применяются прямые и косвенные методы оценки состава микрофлоры кишечника. Прямой метод заключается в изучении содержимого тонкой кишки, полученного с помощью стерильного зонда. Содержимое толстой кишки чаще всего определяется при бактериологическом исследовании кала. Кроме этого, для диагностики применяются гистохимические, морфологические, молекулярно-генетические, комбинированные, нагрузочные пробы и др. Бактериологический метод получил наиболее широкое распространение в клинической практике, однако остается трудоемким, длительным по срокам выполнения и непригодным для скрининговых исследований.

---

Даже если нужно заказать отчет по практике производственной , Work5 справится.

---

Микробиологический метод, как правило, изучает от 14 до 25 показателей. Наиболее информативным методом является микробиологическое исследование с использованием анаэробного культивирования в биоптатах, полученных из разных отделов кишечника (используется, как правило, только в научных исследованиях). Газово-жидкостная хроматография (ГЖХ) представляет собой метод диагностики кишечной флоры по метаболитам (индикан, паракрезол, фенол, 14СО2, аммиак и др.). Спектр определяемых короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) позволяет сделать заключение о таксономическом положении всех микробов, присутствующих в исследуемом материале. Преимуществом изучения КЖК является то, что они характеризуют преимущественно анаэробный спектр микроорганизмов, культивирование которых представляет большие технические сложности. ГЖХ может применяться в качестве экспресс-метода, однако его специфичность составляет 50–90%, а чувствительность – 25–100%. Метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией основан на определении компонентов бактериальных клеток, появляющихся в результате их естественного отмирания или атаки компонентов иммунной системы. В качестве маркеров используют минорные липидные компоненты мембран микробов. По их содержанию и количеству можно определить до 170 видов бактерий и грибов [7]. Таким образом, актуальность исследования обусловлена потребностью медицинской науки в выборе достоверного и менее трудозатратного метода диагностики микробиоты кишечника. Диагноз «дисбактериоз» всё чаще ставится в практической деятельности врача и для эффективного лечения необходима достоверная и доступная диагностика. Объектом исследования являются методы исследования микробиоты кишечника. Предмет исследования – биохимический и масс-спектрометрический метод идентификации микроорганизмов в биологических средах. Цель исследования заключается в сравнительной характеристике биохимических и масс-спектрометрических методов идентификации микроорганизмов в биологических средах. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи: 1. Изучить состав условно-патогенной микробиоты кишечника человека; 2. Оценить роль условно-патогенной микрофлоры в жизнедеятельности человека; 3. Изучить нарушения микробиоценоза желудочно-кишечного тракта человека; 4. Проанализировать методы диагностики микробиоты кишечника; 5. Сравнить биохимический и масс-спектрометрический метод идентификации микроорганизмов в биологических средах; 6. Оценить трудозатраты при биохимических и масс-спектрометрических методах исследованиях; 7. Проанализировать наличие зависимости изменения количества возбудителей от большого каталога масс-спектрометров.

ГХ/МС - новые технологии для решения задач «быстрой микробиологии». Масс-спектрометрия может стать основным методом в будущем, так как это направление продолжает развиваться, а существующие базы данных микроорганизмов непрерывно пополняются. Учитывая скорость развития генетической изменчивости микроорганизмов - и в особенности устойчивости к антимикробным препаратам, - лаборатория микробиологии должна развиваться с еще большей скоростью, а внедрение новых инструментов идентификации микробов с повышенной точностью, скоростью и чувствительностью не должно ограничиваться научно-исследовательскими лабораториями или референс-центрами. Внедрение данного метода в рутинную работу микробиологических лабораторий в ближайшее время неизбежно, а интеграция в уже существующие автоматизированные лабораторные системы радикально изменит порядок исследования, что приведет к повышению качества диагностики инфекционной патологии, сокращению сроков госпитализации больных, улучшению прогноза, снижению финансовых затрат как для пациента, так и для медицинского учреждения в целом. При достижении цели работы были сделаны следующие выводы: 1. При изучении роли, видов условно-патогенная микрофлора кишечника человека установлено, что помимо патогенных свойств, данная часть микробиоты кишечника берет на себя большое количество функций необходимых в процессе жизнедеятельности человека; 2. Нарушения микробиоценоза желудочно-кишечного тракта может происходить под воздействием как эндогенных, так и экзогенных факторов. Снижение количество полезной микрофлоры, усиленный рост условно-патогенной микрофлоры приводит к клиническим проявлениям разной степени тяжести; 3. При анализе методов идентификации микроорганизмов в биологических средах выявлены общие принципы культивирования и идентификации микроорганизмов. В сегодняшней микробиологической практике имеется большое количество разнообразных методов исследования микроорганизмов. Но при рассмотрении каждого метода становиться понятно, что все они имеют определенные преимущества перед друг другом, и недостатки. В настоящее время нет универсального идеального метода идентификации микроорганизмов; 4. При сравнительной характеристике биохимических и масс-спектрометрических методов идентификации микроорганизмов в биологических средах установлено, что классический метод идентификации проигрывает по множественному количеству характеристик масс-спектрометрическому методу. Трудозатраты на проведение биохимического метода во много раз превышают таковых при реализации ГХ/МС. Помимо этого преимущества положительно характеризуют ГХ/МС экспрессность, экономичность, высокая специфичность и способность диагностировать микроорганизмы которые ранее с трудом подвергались культивированию и идентификации; 5. Как и любой метод диагностики, масс-спектрометрия так же имеет недостатки. Это неполная и несовершенная база данных микроорганизмов, которые могут характеризоваться не только в целом, но и по отдельным фрагментам, что может выдавать большое количество возбудителей.

Использование методов MALDI-TOF масс-спектрометрии и количественной ПЦР для быстрой диагностики септических состояний /Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, О.В. Бурменская и др. //Клин. микробиол. и антимикр. химиотерапия. – 2014. – № 1. – С. 4-9. 2. Кирилюк, А.А. Применение методов масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) в современной клинической лаборатории – обзор приложений, преимущества использования, современные подходы и возможности автоматизации /А.А. Кирилюк //Клин. лаб. диагностика. – 2014. – № 9. – С. 92-93. 3. Масс-спектрометрический анализ микробных метаболитов как экспрессный прием оценки состояния природных микробиоценозов в медицинской и санитарно-гигиенической практике. / Жиленкова О.Г., Быстрова О.В., Осипов Г.А., Шендеров Б.А. // Лабораторная служба.- 2016. - Т. 5. - № 3.- С. 43. 4. Сабельникова, Е. А. Клинические аспекты дисбактериоза кишечника / Е. А. Сабельникова // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 111-116. 5. Силивончик, Н. Н. Микрофлора кишечника: характеристика, нарушения и возможности коррекции / Н. Н. Силивончик // Семейный доктор. 2013. № 1. С. 72–81. 6. Слободенюк, В.В. Индивидуальный или эмпирический подход в лечении бактериальных инфекций – куда ведут современные технологии? /В.В. Слободенюк //Клин. лаб. диагностика. – 2014. – № 9. – С. 20-21. 7. Состояние местного иммунитета у новорожденных детей, получающих различные виды вскармливания / В. Р. Амирова [и др.] // Педиатрия. Журнал им. Г. Н. Сперанского. - 2011. - № 1. - С. 84-89. 8. Хурса, Р. В. Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции: учеб. - Метод. пособие / Р. В. Хурса, И. Л. Месникова, Я. С. Микша. – Минск: БГМУ, 2017. – 36 с. 9. Чубенко, Г.И. Методы идентификации бактерий: учеб. - Метод. пособие / Г.И. Чубенко. – Благовещенск: ФГБОУ ВО Амурская ГМА, 2018. – 44 с. 10. Whittaker P. Comparison of Yersinia pestis to other closely related Yersinia species using fatty acid profiles. / P. Whittaker // Food Chemistry. – 2009. – Vol. 116(3). – P. 629-32.